Amostras Biológicas & Ruptura Celular

DE RUPTURA DE CÉLULAS A HOMOGENEIZAÇÃO E PULVERIZAÇÃO DE UMA GRANDE VARIEDADE DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Preparar amostras biológicas como ossos, plantas, músculos ou muco para análise de DNA, RNA, proteínas ou metabólitos pode ser um desafio. A RETSCH conta com moinhos de laboratório que pulverizam e homogeneízam amostras sólidas, mas também são apropriadas para ruptura celular. Os moinhos RETSCH são usados em áreas como biotecnologia, diagnósticos, ciência forense, agricultura e microbiologia.

Ruptura de células de microrganismos (em suspensão)

Ruptura de células são frequentemente o método de escolha para extrair componentes celulares de bactéria, fermento, fungos ou microalgas e é efetuada química ou mecanicamente. Métodos mecânicos são melhores para células com extremidades fortes, ou se os elementos químicos podem afetar a extração e, portanto, precisam ser evitadas. Um método comum e efetivos é o batimento de esferas que utiliza esferas quebrar as células em suspensão. Batimento de esferas podem ser feitas em pequena ou larga escala, usando diferentes tipos de frascos e tubos. Uma maneira é unir a suspensão com esferas e usar um misturador vortex. No entanto, este procedimento é lento e inconsistente, especialmente com um grande número de amostras ou longos períodos de ruptura. Um jeito melhor é usando os Moinhos Misturadores RETSCH com adaptadores que automatizam o processo, tornando-o rápido, eficiente e reproduzível.

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Moinho misturador MM 400 - Ruptura de células de levedura*

_{*O vídeo mostra o modelo anterior com princípio funcional idêntico.}

^{Reprodutibilidade aumentada do total de concentração de proteína após ruptura de célula, 7 minutos no MM 400, 12 minutos no Vortex.
Barras de erro: % de desvio de padrão}

O MM 400 processa até 20 amostras em tubos Eppendorf de 1.5 ou 2 ml sem contaminação cruzada, o que poupa o tempo do operador. Além disso, um adaptador está disponível para acomodar até tubos Falcon de até 50 ml. O tamanho ideal de esferas para ruptura celular varia baseado no tipo de célula; para bactéria e fermento, esferas de vidro variando de 0.75 a 1.5 mm são recomendáveis, enquanto esferas menores de 0.1 a 0.5 mm são mais ideais para fungos e microalgas. Para extração de DNA ou RNA, tubos descartáveis menores de ate 2 ml são ideais, enquanto frascos maiores como tubos Falcon de 50 ml são melhores para processar proteínas e metabólitos. Os parâmetros de batimento de esferas ideais variam de acordo com o tipo de célula. Podem ser necessários alguns experimentos até encontrar os melhores resultados. Normalmente, 30 segundos (a maioria das microalgas) a 7 minutos (fermentos em geral) de batimento de esferas são necessários para total ruptura das células. Ao aceitar até 50 frascos descartáveis de 2 ml, o Misturador MM 500 Vario efetivamente aumenta a taxa de transferência de amostras.

Células de phaeodactylum tricornutum antes (esquerda) e depois da ruptura de células (direita) com o Moinho Misturador MM 400 em combinação com o adaptador de tubos Falcon.

Temperatura de controle para batimento de esferas em suspensão de células

A temperatura desempenha um papel crucial, especialmente para aplicações onde proteínas sensíveis à temperatura estão envolvidas. Uma solução é a moagem criogênica (ver seção correspondente), a outra é resfriar a suspensão celular. Para o MM 400, foi demonstrado que o aumento de calor em tubos de 2 ml é moderado mesmo a 30 Hz; uma maneira simples é interromper os tempos de ruptura de menos de 1 minuto com o resfriamento do adaptador com os frascos em um banho de gelo por um minuto. Desta forma, a temperatura permanecerá abaixo de 12-15°C, dependendo do tamanho das esferas usadas.

^{Aumento de temperatura durante a ruptura de células no MM 400 a 30Hz, ou com um agitador Vortexer, esfriando em gelo após cada minuto de ruptura de células.}

Uma maneira de controlar o desenvolvimento da temperatura no batimento de esferas é usando o Mixer Mill MM 500 control. Um adaptador especial acomoda 18 frascos descartáveis de 2 ml por lote. A máquina é conectada a um chiller com água resfriada a 4°C que, por sua vez, resfria o adaptador que segura os frascos. Desta forma, a temperatura da suspensão é mantida em torno de 13°C, mas sem as inconvenientes fases de interrupção manual em um banho de gelo. Enquanto o MM 500 control não aceita o adaptador de tubo descartável falcon, ele pode ser usado com frascos de moagem de aço inoxidável nos volumes de 50, 80 ou 125 ml (veja o exemplo à esquerda: P. pastoris).

Se o moinho for utilizado com nitrogênio líquido e o CryoPad e ajustado para uma temperatura de 0°C, a temperatura da suspensão celular em tubos descartáveis de 2 ml pode ser mantida em 0°C sem congelar a suspensão, de modo que a batida de esferas efetiva ainda é possível.

Homogeneização de amostras macias e resistentes

Algumas amostras biológicas, como muco de pacientes com fibrose cística ou espécimes de tecidos como fígado, pulmão ou tumores, às vezes são mais difíceis de homogeneizar completamente. Os tubos descartáveis de 2 ml muitas vezes são pequenos demais para comportar todo o volume da amostra, então a amostra tem que ser dividida e recombinada após o processo de homogeneização, o que adiciona trabalho extra e tempo à rotina do laboratório. Grandes frascos de moagem feitos de aço inoxidável, por exemplo, podem conter todo o volume da amostra, mas precisam ser limpos após cada uso. Um adaptador para o Mixer Mill MM 400 resolve esse problema permitindo o uso de 5 x tubos descartáveis de 5 ml, que têm mais capacidade e não requerem limpeza. Por lote, 10 amostras podem ser homogeneizadas simultaneamente. Tubos falcon de 50 ml também podem ser usados para homogeneizar amostras de tecido. Aqui, 8 amostras por lote podem ser processadas em apenas alguns minutos.

Amostra de fígado antes e depois da homogeneização no MM 400

Moagem criogênica de amostras biológicas

Algumas amostras biológicas, como plantas fibrosas, veias duras, unhas, ou alguns tecidos animais ou de tumor, são difíceis de homogeneizar num sistema tampão. Eles são macios, duros ou fibrosos demais para ser pulverizados de maneira efetiva em suspensão. Uma alternativa melhor para estas amostras é a moagem criogênica, que envolve congelá-las em nitrogênio líquido antes ou durante o processo de moagem. Esta técnica faz as amostras quebradiças e fáceis de moer até formarem um pó homogêneo. A moagem criogênica também tem o benefício de preservar a integridade de proteínas ou compostos voláteis que podem se degradas ou evaporar em temperaturas mais altas, por exemplo. Além disso, a moagem criogênica pode quebrar as organelas intracelulares de alguns organismos, como fermento.

Para amostras pegajosas como framboesa, a moagem criogênica é frequentemente o único método possível para obter uma amostra uniforme. A tabela lista alguns exemplos de materiais de amostra que foram processados de maneira bem sucedida pela moagem criogênica no Moinho Misturador MM 400 ou no CryoMill. Tubos de aço de 2 ml pode ser usados para moagem criogênica no MM 400. Efeitos similares podem ser obtidos no MM 500 control com potes de moagem de até 125 ml para volumes maiores de amostra. Aqui, o CryoPad deve ser usada para trabalhar com nitrogênio líquido. Em todos os moinhos mencionados, tubos de aço de 2 ml e os adaptadores correspondentes também são disponíveis para um volume de amostras menor.

^{Tubos de aço inoxidável de 2 ml}

Amostra	Acessórios	Feed quantity	Tempo de moagem	Velocidade	Máx. finura final (d90)/
E. coli Bactéria	2 potes de moagem de aço inoxidável de 50 ml 2 bolas de moagem de aço inoxidável de 25 mm por pote	2 x pellets de células congeladas de 10 ml	2 min	30 Hz	Ruptura celular completa
Tecido muscular	Pote de moagem de aço inoxidável de 50 ml Bola de moagem de aço inoxidável de 25 mm	10 g	4 min	25 Hz	<150 µm
Folha de pinheiro	2 adaptadores para dez frascos reagente de 2 ml cada um 2 x bolas de aço inoxidável de 5 mm por frasco		3 min	30 Hz	Extração de 20 amostras de RNA reproduzível em um passo
berries	Pote de moagem de aço inoxidável de 50 ml 4 x bolas de moagem de aço inoxidável de 15 mm	2 g	40 secs	20 Hz	<200 µm
Unhas	Adpatador CryoMill para 4 x frascos de 2 ml 4 bolas de moagem de aço inoxidável de 5 mm por frasco	1 unha por frasco	2 min	25 Hz	<200 µm
Estômago de rato	Pote de moagem de aço inoxidável de 35 ml 1 x bola de moagem de aço inoxidável de 20 mm	1.8 g	2 min	30 Hz	<150 µm

^{Pedaços de carne antes de depois da moagem criogênica}

^{Framboesas
antes e depois de moagem criogênica}

^{Agulhas de pinheiro
antes e depois da moagem criogênica}

^{Gel de agarose para separação de RNA de agulhas de pinheiro mostrando boa reprodutibilidade e quantidade de RNA preparado.}

Amostras forenses

Amostras forenses como cabelo, ossos e dentes são frágeis e, portanto, normalmente não precisam de resfriamento antes da pulverização. Para alcançar a finura analítica desejada, as amostras devem passar por uma moagem preliminar num britador de mandíbulas ou moinho de corte para reduzir o tamanho de suas partículas para menos que 10 mm para processamento maior num moinho de bolas. Moinhos de corte são usados para uma moagem prévia de ossos que podem estar frescos e, portanto, não estão completamente secos e podem até conter resíduos de carne. RETSCH oferece uma variedade de moinhos de corte para redução primária de tamanho de materiais de amostra macios, de dureza média, elásticos, resistentes e fibrosos. A grande variedade de acessórios permite uma adaptação otimizada a várias aplicações. O SM 300 pode ser ajustado com 3 rotores diferentes e peneiras inferiores de 0.25 a 20 mm. Diferente de ossos frescos e gordurosos, ossos secos podem ser reduzidos a um tamanho de menos de 0.25 mm em um ou dois passos. O SM 300 possui uma velocidade variável de 100 a 3.000 rpm. A pulverização de ossos ou dentes ou cabelo são majoritariamente conduzidos em moinhos de bolas utilizando esferas de mais de 5 mm feitas de aço, óxido de zircônio ou carbeto de tungstênio.

^{Amostra de ossos antes e depois de moagem num moinho de corte}

^{Cabelo humano antes e depois de moagem num moinho misturador}

Procedimento de lavagem para obter células intactas de tecido humano

Uma das potenciais complicações da cirurgia de substituição articular, como para cotovelos ou joelhos, é a infecção do tecido circundante por várias bactérias. Essas infecções, chamadas infecções de prótese articular (PJI), podem ocorrer a qualquer momento, desde alguns dias até vários anos após a cirurgia. Elas são difíceis de tratar porque diferentes tipos de bactérias podem causá-las, e nem sempre são detectadas pelos métodos convencionais. Portanto, é necessário isolar as bactérias das amostras de tecido de uma maneira que preserve sua viabilidade e permita sua identificação e cultivo. É aqui que o Mixer Mill MM 400 pode ajudar com um procedimento simples: As amostras são misturadas com 20 ml de água desmineralizada estéril e 5 ml de esferas de vidro de 1 mm em um frasco de aço esterilizado. Podem ser utilizados frascos descartáveis de boca larga de 30 ml. Até 8 frascos são agitados por 3,5 minutos a 30 Hz para remover as bactérias das amostras sem destruí-las. As bactérias podem então ser facilmente cultivadas em uma placa de ágar para análises posteriores. Este método tem uma alta taxa de detecção (A.-L. Roux et. al., 2010) e pode ser aplicado a qualquer amostra de tecido sólido infectado, mesmo que contenha material implantado.